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        平台介绍

               KASP方法即Kompetitive Allele-Specific PCR(竞争性等位基因特异性PCR),可以用2个荧光探针、2个通用淬灭探针,再加多个位点特异探针来检则多个SNP位点,这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions,插入和缺失)。原理上类似Taqman检测,也是基于终端荧光读取判断,每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型,而KASP技术与Taqman技术不同的是,它不需要每个SNP位点都去合成特异的荧光引物,它基于自己独特的ARM PCR原理,让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增,这大大降低了LGC KASP的试剂成本,既有金标准的准确,又降低了使用成本,比Taqman还具有更好的位点适应性,所以在医学、农学检测方面KASP都有非常好的应用。

         

         

        检测原理

        第一步:设计2SNP PCR引物,各对应于一个SNP的等位基因,如下图:

        Allele 1引物3'末端是Callele 2引物3'末端是A标签序列;Allele 1引物5'末端是F序列;allel 2引物5'末端是H标签序列。

         

         

        第二步:第一轮PCR,模板会与可互补的(3'末端能配对的)PCR引物进行退火,并发生扩增,这步完成SNP识别。

         

        第三步:第2PCR扩增,扩增出带有标签序列的PCR产物,这步完成把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物。

         

         

        第四步:经过接下来几轮的PCR扩增,一方面淬灭探针被切碎,另一方面荧光探针更多地退火到新合成的、没有淬灭基团的互补链上,发出荧光。

         

         

        结果示例

        针对SNP位点(A/G)设计KASP引物,对30个材料进行KASP分型验证,结果如图所示。

        红色:纯合类型1(野生型),基因型为A:A;蓝色:纯合类型2(纯合突变体),基因型为G:G;绿色:杂合类型(杂合突变体),基因型为G:A

         

         

        技术特点

        (1)只要合成两个通用荧光探针,两个通用淬灭探针,再加合成多个针对具体位点的SNP PCR引物,就可以测许多位点。

        (2)因为荧光探针和淬灭探针相对较贵,KASP方法相比于Taqman方法,可以通过通用荧光探针来代替针对位点的荧光探针,大大节约成本

         

         

        技术路线

        配置PCR体系

        三种成分依次加入

        PCR板进行密封

        Touch down PCR

        PCR结束后,读取荧光信号

        由于SNP的不同,样品聚类

        数据输出

        送样要求

        1. 请提供血液、组织或DNA样品,及准确的基因名称(基因ID)、序列和详细的SNP位点信息。

        2. 血液:样品需用EDTA抗凝,总量大于1 ml,采集后于-20℃或-80℃保存。

        3. 组织:样品可为新鲜组织(最好保存于-80℃)、石蜡包埋的组织或95%乙醇中固定的组织,总量≥10mg。样品-70℃邮寄至本公司(干冰或液氮运送)以保证样品质量。

        4. 基因组DNA:浓度≥20ng/μl,总体积≥20μl。所需样品量根据实验要求做相应调整。

        5. PCR产物:达到实验要求的PCR产物,浓度≥50ng/μl,总体积≥20μl

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