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        • 产品名称: DNA测序常见问题及解答
        • 时间: 2014-12-20
        • 浏览次数: 662

         

        DNA测序服务常见问题及解答

         

        Q1. 为什么过短的PCR产物不适于直接测序?

        答:首先纯化过短的PCR产物比较困难,一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp,而且过短的PCR产物的准确定量也非常困难。其次,模板太短的PCR测序受外界的干扰比较大,很容易造成测序失败。因此我们要求用于测序的PCR产物的长度一般不低于150bp

         

        Q2. DNA片段很长,一个反应测不到头,怎么办?

        答:可以分别用两端引物进行双向测序,让其中间部分的序列交叉互补,便可完全测通。如果这样还测不通,可在已经测出序列的500700个碱基处设计测序引物作进一步测序(即Primer Walking),便可完全测序。

         

        Q3. 为什么在primer walking时总将引物设计得那么靠前?

        答:我们在设计引物时有两个准则。一是用于设计引物的序列必须准确,二是在引物区之后还必须有足够的准确序列用于拼接。这样我们设计引物的位置就必然在已测序的准确序列的末尾之前一段位置上,在满足软件设定的条件下,我们总会选取最靠近3端的引物来作为最终的测序引物。

         

        Q4. 我有一个4KBPCR片段,希望你们帮我测通。

        答:大于2KBPCR片段要测通最好是构建到克隆后再进行测序。这样模板更加稳定,测序效果也更加好一些。

         

        Q5. PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?

        答:众所周知,PCR圹增过程中会出现错配现象,但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时,测得的是PCR产物众多分子混合物的结果。若某一个位点上出现了错配现象,一些PCR产物(约几十个分子)在该位点上存在错配,但大多数分子(约几十万个分子)在这个位点上还是正确的,因此测序时,错配现象是反映不出来的。而PCR片段经克隆后测序是测定某一个PCR产物分子的DNA序列。在几十轮循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个分子的任何位点都不发生错配。因此,PCR片段经克隆后的测序结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象,在PCR反应时,请选用保真性能高的DNA聚合酶。

         

        Q6. 我测得的基因序列为什么与标准序列有差别?

        答:原因可能是:

        PCR扩增过程中产生错误; 

        ②载体扩增或保存过程中发生突变;

        ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。

        解决措施有:

        ①排除模板、PCR扩增或载体相关的错误;

        ②双向测序。

         

        Q7. 我要求53正向测序,为什么你们给我的序列是反的?

        答:我们是按照您所选择的引物来测序的,有可能该序列与您手中资料上的序列的方向相反,也可能是目标片段的插入方向与您预期的相反。填写测序要求时,请不要使用3引物和5引物这样的字样,而应以T7T3SP6M13fM13r等形式来填写,或注明酶切位点方向比如“测序方向EcoRIHindIII。如果您提供的载体比较特殊,还需要您提供质粒的相关图谱等资料和信息。

         

        Q8. 为什么我的测序序列起端有时会有一些N值?

        答:该种情况主要发生在PCR产物直接测序上。由于PCR产物本身是一个混和溶液,相近的片断又很难割胶纯化出来,这样和引物结合就很容易产生系列杂合序列就会造成在某些位置上有套峰,整个测序信号都非常好,这是由于套峰产生的N值。该种情况明显是客户的样品问题。通过将PCR产物克隆后进行测序,可以解决此种情况的N值问题。

         

        Q9. 为什么找不到我的PCR引物?

        答:有以下几种情况,我们将无法找到PCR引物序列 :

        · 用PCR引物作为测序引物进行测序时,所测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的,所以自然找不到测序引物的序列。有两种方法可以得到测序引物序列。①对于较短的PCR产物(<800bp),可以用另一端的引物进行测序,一直测到序列的末端,就可以在序列的末端找到您的引物的反向互补序列。②对于较长的序列,一个测序反应测不到头,可以将您的PCR产物克隆到适当的载体中(比如T载体),用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与插入序列之间还有一段距离,因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出,因此,您如果想得到您的PCR产物的完整序列,最好克隆后进行测序。

        · PCR产物用T载体克隆后,由于克隆的方向是随机的,因此,当您在一条链上找不到您的引物序列时,试图在互补链上寻找您的引物序列。

        · 当测序引物离您的插入片段很近时,有时可能也无法找到您的引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端有未去除的染料或引物二聚体的干扰,造成起始区的序列不好,可能无法找到您的引物完整序列。

        · 有时,质粒做模板进行测序时,由于某些原因,质粒上没有插入外源目标片段,或为空载体,所测的序列完全为载体序列,此时自然也找不到引物序列。

         

        Q10. PCR测序后面很多杂信号?

        答:PCR产物直接进行测序,序列结束后无反应信号。PCR产物测序一般末端的一个碱基为A(绿色峰),这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基,我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的,这样我们很容易辨别PCR产物结束的位点。在此序列以外就不是我们所要的序列了。

         

        Q11. 测序结果不到800bp还照常收费了,为什么?

        答:如果样品的DNA序列分布匀称,没有复杂结构,正常的测序反应能保证达到800bp以上。但有一些DNA序列立体结构复杂,造成聚合酶延伸反应终止,测序信号突然减弱或消失,或者测序结果出现套峰现象,出现这些现象是由DNA模板本身所造成,诺赛会根据具体情况收取费用。

         

        Q12. 我的样品你们已经测通了,但为什么在overlap区有这么多的错配,给出的全序列和单个报告也称作差异,我该相信谁?

        答:给出的全序列是一个拼接的结果,当互相拼接的两个序列存在差异时,应该以序列质量更好的应该为主。

         

        Q13. 我的样品送测序前已经鉴定过了,有插入片段的,为什么你给我的测序结果是一个空质粒?

        答:造成这种现象主要有两个原因:

        · 鉴定过程中的假阳性。鉴定插入片段主要是通过PCR和酶切两种方式鉴定。由于PCR反应受多种条件的影响,在鉴定过程中易产生假阳性,而酶切鉴定是比较可靠的鉴定方式。

        · 我们由于条件的限制,无法单独的对某一个客户的样品进行特定条件的培养,所以可能在培养过程中发生插入片段的丢失。由于这种情况的发生无法事先预期到,所以我们也只能对出现这样情况的客户说抱歉。客户可以直接提供质粒。

         

        Q14. 测序完成后,测序样品和引物将如何处理(或保存)?

        答:客户需要将测序样品或引物(客户自带的)返还时,我们在测序完成的同时,按客户要求返还样品或引物(客户自带的)。对于没返回的测序样品,公司负责保存1个月(引物3个月),超过1个月还需测序的样品,请客户另行提供。

         

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