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        • 产品名称: >引物合成
        • 上架时间: 2014-10-08
        • 浏览次数: 2656

         

          

         

         

         

         

        平台介绍

               诺赛基因最新引进多台国际最先进、性能最好的Dr Oligo192 DNA合成仪和全部进口合成试剂,日产通量可达30000个碱基,保证了一流的引物合成质量和及时的交货时间。

         

        特色
          先进的设备和全部进口试剂:诺赛可以高质高效地为客户精确合成各种类型的引物。
          技术精湛、业务全面的DNA合成技术团队,提供各种标记修饰和全长基因合成业务。
          严格的质量保证:通过自动处理订单,有效避免人为失误,提供OPCPAGEHPLC多种纯化方法,可以去除所有的合成失败、修饰失败,脱盐失败等质量偏差,满足克隆,测序和扩增等实验需求。
          合成周期短:轮流班次高效工作,所有引物合成的交货时间不超过3个工作日,普通引物保证24小时内发货。

         

        质量控制
          严格脱盐:离心管中不含肉眼可见的盐结晶物。
          纯度保证:本公司保证提供客户要求的PAGEHPLC等纯化方式,并提供质谱检测服务。
          准确定量:本公司提供的oligo产品均以OD值定量。此定量值为使用Nanodrop8000紫外分光光度计,每个样品测量三次,偏差在10-2数量级以内的平均值。
          若引物有质量问题,请即刻与我们联系,我们将在24小时之内免费为您重新合成。

         

        客户提供

          提交引物合成订购表,其中包括引物名称、序列(5-3’)、OD值、纯化方式等信息。

         

        引物修饰合成类型

         

        反义DNA合成

        BIOTIN修饰DNA

        NH2SH修饰DNA

        Dark Quenchers

        硫代碱基

        5Biotin

        5NH2 C6

        3BHQ -1

        DNA碱基

        3Biotin

        3NH2 C6

        3BHQ -2

        2F-RNA

        中间Biotin dT

        5NH2 C12

        3Dabcyl

        2-O-Methyl碱基

        5PC Biotin

        中间NH2 C6 dT

        5Dabcyl

        5-Methyl dC

        5Dual Biotin

        Uni-Link NH2

        3Eclipse

        5FITC6-FAM

         

        5SH C6

         

         

         

        3SH C3

         

         

         

        Dual SH

         

          

               诺赛建议反义DNA最好选用HPLC纯化,这样可以加强反义DNA的表现性能和降低产品中的盐份。反义DNA中如含有2F-RNA5FITC标记或5-Methyl dC,则免收HPLC纯化费。

          所有BIOTIN修饰DNANH2SH修饰DNADark Quenchers DNA产品全部采用HPLC纯化。

         

        碱基修饰DNA

        Spacer修饰DNA

        其它修饰DNA

        dI (脱氧次黄嘌呤)

        C3 Spacer

        5’磷酸化

        dU (脱氧尿嘧啶)

        Spacer 9

        3’磷酸化

        2-Aminopurine

        3C6 Spacer

        5’地高辛

        5-Bromo dU

        Spacer 18

        3’地高辛

        3Inverted dT

        dSpacer

        5CHCH(炔基)

        3ddC

        PC Spacer

        5CHO(醛基)

         

         

        5COOH(羧基)

         

         

        5Acrydite

         

         

        5-Nitroindole

         

         

        3Cholesteryl

         

               碱基修饰DNASpacer修饰DNA和其它修饰DNA产品需按实际情况选择纯化方式。  

         

        荧光标DNA

        吸收&发射波长(nm)

        双标记
        DNA探针

         

        分子信标

         

        5’6-FAM

         

        荧光基团

        淬灭基团

        荧光基团

        淬灭基团

        中间6-FAM-dT

        495&520

        5’6-FAM

        3’TAMRA

        5’6-FAM

        3’Dabcyl

        3’6-FAM

        495&520

        5’6-FAM

        3’BHQ-1

        5’TET

        3’Dabcyl

        5’TET

        495&520

        5’6-FAM

        中间 BHQ-1 dT

        5’HEX

        3’Dabcyl

        5’HEX

        522&539

        5’6-FAM

        3’Eclipse

        5’TAMRA

        3’Dabcyl

        5’TAMRA

        538&555

        5’TET

        3’TAMRA

        5’CY5

        3’Dabcyl

        3’TAMRA

        559&583

        5’TET

        3’BHQ-2

         

         

        中间TAMRA-dT

        559&583

        5’HEX

        3’TAMRA

         

         

        5’ROX

        559&583

        5’HEX

        3’BHQ-1

         

         

        3’ROX

        588&608

        5’HEX

        3’BHQ-2

         

         

        5’Texas Red

        588&608

        5’HEX

        中间 BHQ-1 dT

         

         

        5’ Cy3

        588&608

        5’TAMRA

        3’Eclipse

         

         

        中间Cy3

        550&564

        5’TAMRA

        3’BHQ-2

         

         

        3’Cy3

        550&564

        5’ROX

        3’Eclipse

         

         

        3’Cy5

        550&564

        5’ROX

        3’BHQ-2

         

         

        5’Cy5

        550&564

        5’CY5

        3’BHQ-2

         

         

        5’Cy5.5

        648&668

        5’CY3

        3’BHQ-2

         

         

        5’AMCA

        685&706

        5’JOE

        3’BHQ-2

         

         

        3’AMCA

        353&442

        5’Texas Red

        3’BHQ-2

         

         

        5’JOE

        353&442

         

         

         

         

        3’JOE

        529&555

         

         

         

         

        AlexaFluor488

        529&555

         

         

         

         

        5’Methylene Blue

        492&517

         

         

         

         

        3’Methylene Blue

         

         

         

         

         

         

        诺赛提供

        引物的冻干粉;

        引物说明书。

         

         

        引物合成服务常见问题及解答

         

        Q1.样品管内有一个点状物?
        答:如果寡核苷酸过度加热,将出现一个可见的点状物贴在管子的底部,但这并不影响寡核苷酸的质量,而且更容易溶解在水里面,有些非荧光标记的寡核苷酸可能出现有黄色或者其他半透明的黏状或者颗粒状物质,原因是量大或者含有吸光特性。

         

        Q2.寡核苷酸应如何保存?
        答:①干粉状态的寡核苷酸很稳定。②将寡核苷酸保存在高浓度的状况下也比较稳定。一般情况下,我们建议用RNase-freeTE (pH 8.0) 缓冲溶液溶解寡核苷酸配制成100 umol/L的储备液(溶解体积:V (ul)= 物质的量×10×OD值),分装成小份,-20℃保存。尽量避免反复冻融。③荧光探针必须避光保存。④巯基很容易被氧化成二硫键,失去原来的作用,一般管内充入氩气保护,收到产品后如果不用,请不要开盖。溶解后如果长时间不使用,请在溶液中加入适量的DTT,混匀后配成浓度为50mmol/L的溶液保存,下次使用前需要酒精沉淀纯化。

         

        Q3.测量后跟报告单上的量不符合?
        答:为避免样品丢失,开启EP管盖溶解之前最好离心1分钟,或管垂直向上在桌面上敲打几次,将样品收集到管底。
        引物可能附着在管壁上,为使寡核苷酸完全溶解,加完TE后,需保证寡核苷酸被涡旋震荡30分钟,或者上下吹打至少十次。如果以上方法均不能使测量量与报告单上的量相符合,请及时与我们联系。

         

        Q4.为什么有时候OD260/OD280小于1.8
        答:嘌呤和嘧啶消光系数并不相同,吸收最高峰在257nm-279nm之间,因此碱基组成不同的单链寡核苷酸的260nm/280nm比值范围在1.402.25之间,并不像双链的DNA那样,因此不能用260nm/280nm比值来衡量没有经过计算碱基组成的寡核苷酸。如果嘌呤嘧啶含量比较平均,可以通过此比值来估算衡量纯度。

         

        Q5.如何检测寡核苷酸?
        答:配制16%的变性聚丙烯酰胺凝胶,取适量的引物(不能过载),用尿素饱和溶液溶解,上样前加热变性(95 ℃,2 min)。用指示剂标记,电泳使条带尽可能靠下,然后将凝胶放在荧光TLC板上在波长254nm下观察条带位置,如果主带之下没有杂带,说明纯度较好。含有相同长度的不同碱基组成的寡核苷酸电泳速度稍有差异,含有兼并碱基的寡核苷酸容易出现弥散条带,并且容易出现二级结构(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,即引物二级结构条带)
        不能用EB染色来检测单链寡核苷酸的长度,更不能用来定量。

         

        Q6.引物的分子量是如何计算的?
        答:引物分子量计算公式:MW= A×313.21 + G×329.21 + C×289.18 + T×304.2 + M×301.2 +R×321.21 + W×308.71 + S×309.2 +Y×296.69 + K×316.71 + V×310.53 + H×302.2 + D×315.54 + B×307.53 + N×308.95 +Ns×16 + Nm - 61.96
        公式中Ns=硫代碱基个数,Nm=修饰基团分子量。兼并碱基分子量取相应碱基分子量的平均值。

         

        Q7.如何计算引物的Tm值?
        答:引物Tm值与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。
        Tm计算公式为:Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) 600/碱基数。
        对于长度为20base以下的引物,可以用Tm = 4(G + C)+ 2(A + T)进行估算。
        注意,实际Tm也因为不同引物的碱基排列不同而有差异,公式计算出的Tm值只是一种估算,仅供参考,建议设置梯度以找到最适合的Tm

         

        Q8.如何将两条互补的单链退火形成双链?
        答:用TE缓冲液(10 mM Tris50 mM NaCl1 mM EDTApH 7.5-8.0)溶解引物,终浓度为50250umol/L,将要退火的引物等摩尔数混合,加热到94℃两分钟,然后缓慢冷却至室温即可。

         

        Q9.寡核苷酸片段退火后不能连接到载体上?
        答:没有特殊要求的的寡核苷酸两端均为羟基(扩增后的PCR产物的5′末端也没有磷酸基团),如果需要退火后直接连接到载体上,需要将两端磷酸化(激酶处理或者合成时说明需要磷酸化)。退火条件,磷酸化程度,酶切效果都可能影响结果。

         

        Q10.引物刚开始是可以PCR,后来就没有反应?
        答:可能是引物降解了。建议使用pH8.0左右的缓冲液低温保存引物,最好分装成多份,避免反复冻融。可将引物样品送诺赛检测是否降解,由客户承担相应费用。
        还有些引物可能自身退火或者分子内回旋配对而影响PCR效果。将引物在进行PCR前分成一小份,加热到94℃两分钟,再在冰上快速冷却引物,然后加入PCR反应。
        另一种可能是模板降解了。

         

        Q11.PCR产物经克隆后测序发现引物处的碱基有错误?
        答:并不排除其他实验问题引入的错误,所以建议挑选不少于两个克隆送测序,如果都存在相同的引物处碱基错误,我们将为您重合。

         

        Q12.当用溴化乙锭染色时,为什么看不到硫代磷酸化寡核苷酸?
        答:硫代磷酸酯键可以淬灭溴化乙锭的荧光,硫代磷酸化寡核苷酸有正常的254nm紫外吸收波长。但与溴化乙锭染色后,在365nm下没有吸收,而在同一凝胶上,没有硫代磷酸化的寡核苷酸可正常显色。

         

        Q13.FITC5-FAM6-FAM的荧光标记之间有何区别?
        答:都是荧光素标记(Fluorescein),5-FAM6-FAM互为异构体,二者没有区别,而FITC则在与oligo的连接方式上(硫脲键)有别于前者(酰胺键),通常使用中没有区别,但FAM更稳定。

         

        Q14.淬灭基团TAMRAEclipseBHQ系列染料的在双标记荧光探针使用上有什么不同?
        答:TAMRA为荧光染料,在淬灭报告基团的同时,自身会在更高波长处发射荧光,此发射荧光会对报告基团的检测造成部分影响,探针荧光本底相对较高。而EclipseBHQ系列为非荧光染料,能淬灭报告基团,但自身不发射荧光,因此,探针荧光本底低,信噪比更大,检测灵敏度更高。但每种染料在不同的位置有特异的吸收效果,所以要需要根据具体实验需求进行选择。 

         

         

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