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        • 产品名称: 基于Miseq的微生物多样性分析常见问题解答
        • 时间: 2015-02-10
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         基于Miseq的微生物多样性分析常见问题解答

        1. Q:哪些环境样品可以进行微生物多样性检测?

            A针对宿主相关样品如皮肤、口腔、呼吸道、消化道、生殖道等进行研究;针对环境相关样品,如土壤、水体、空气、盐湖、沼泽等进行研究。 

         

        2. Q:基于高通量测序的环境微生物多样性检测技术有何优势?

            A常规的宏基因组学研究方法包括基因克隆文库、变性梯度凝胶电泳DGGE/TGGE等,但这些方法的通病是信息量太小,不能充分反映复杂的环境微生物多样性和分布。

             基因克隆文库构建和检测的工作量大,且自然界中99%的微生物在实验室都没有办法纯化培养,从培养基上挑取克隆菌株,摇菌转化测序,效率低下。DGGE法曾经广泛应用于检测微生物群落结构的多态性,但是需要标准菌株,且受到凝胶电泳特性的局限,无法检测到稀有菌群的种类,因此其重复性和分辨率都不甚理想。

                第二代高通量测序无需构建质粒克隆文库,这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差,可以直接对环境样品中的基因组片段进行测序,简化了基本操作,提高了测序效率,它能够对一个群落中微生物的多样性作更加深入和全面的描述,且具有通量高,重复性好,精确度高的优点,因而在微生物生态学研究中逐渐占据了优势。

         

        3. Q:微生物多样性检测原理是什么?

            A细菌含有的16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约为1542bp,其分子大小适中,突变率小,是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系,而可变区序列则能体现物种间的差异。

               传统的真菌分类鉴定主要是按照真菌的形态、生长以及生理生化等特征对真菌进行分类。然而真菌的种类繁多,个体多态性明显,而且其生长、生理生化特征也会随着环境的变化而不稳定。因此采用传统的方法对真菌进行真确的分类存在较大的困难。随着分子生物学技术的发展,核酸序列分析已被广泛的应用于真菌分类鉴定中,目前常用的技术包括18S rDNA、ITS(Internal Transcribed Spacer)、及18S rDNA-ITS序列分析技术。

                18S rDNA是编码真核微生物核糖体小亚基rRNA(18S rDNA)的DNA序列,序列中既有保守区又有可变区,保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系,而高变序列区域则能体现物种间的差异。由于18S rDNA在进化速率上比较保守,因此在系统发育研究中较适用于种极以上的分类、内转录间隔区ITS位于核糖体rDNA18S、5.8S及28S之间,由于不需要加入成熟核糖体,因此在进化过程中能够承受更多的变异,其进化速率为18S rDNA的10倍,属于中度保守的区域,利用它可研究种及种以下的分类阶元。另外,也可通过选择引物同时扩增18S rDNA和ITS,通过分析18S rDNA序列,先在较高级别上确定样品的归属,然后根据ITS序列,将真菌归类到种或亚种水平。

         

        4. Q:诺赛基因可针对微生物的哪些高变区进行测序分析?      

        A采用Illumina MiSeq平台,可对细菌V3/V4/V6的单V区、V5-V6实现双V区测序;同时可以实现对古菌V5~V6双V区进行测序。

         

        5.Q: 测序时间一般多久?

        A一般从PCR产物检测合格之日算起,包括建库,上机和标准生物信息分析,大约25-35个工作日内完成。如果样本过少(几个),可能需要增加5个工作日来排样。

          如果需要高级生信分析,另外增加5-10个工作日;不在服务项目中的高级生信,需要开展项目前我们评估后出具体方案。

         

        6.Q: 1次上机可以跑多少个样本?

        A具体而论。理论上跑1个run,大概有效数据在5G-7G(clean reads)左右。用PE300读长来换算,约800-1000万条reads,按平均每个样本4万条算,约可上机100~150个(排除质量较低的样本)。Barcode一般是6个随机碱基,理论有46个=4000余种组合,但是实际上机个数需同时考虑:建库个数建库PCR偏好性定量准确性。Illumina官方给出的参考index是9×12=108种组合。我们开发了适合16S测序的额外barcode,将barcode扩展到了284个,我们做过200余个样本的测试,数据结果也可以使用。但一般的项目我们为了确保数据质量,不会采用这种方法。

         

        7.Q: 样本有的测那么多,有的测那么少怎么办?

        A从前面shannon图和otu累计百分比图来看,普通样本大约5000条已经能测到80%以上的物种,而我们定量一般都按照平均3-4万条reads来做的。由于存在人工混样操作误差,及建库时PCR扩增效率和偏好性不同,每个样本测到的条数一般会存在差别,但对于测到5000条以上是没有问题的。目前还有一种分析方法,用resampling随机抽样,每个样本均抽取8000条左右,再做下游分析,也是可以的。所以一般不必要为测到的深度不够而担心。

         

        8.Q: 为什么我的样本中OTU划分出了那么多?

        A分析最关键的是上游的过滤步骤:将不合格的序列剔除及截齐序列的位置。一般我们按97%相似度来划分,对于300-400bp的序列,差别只有十余个碱基,因此即使1个碱基的误差也会对OTU造成影响。分析时已经采用pre.cluster方法降噪。

        另一方面,根据分析经验,约不到10%的OTU含量占了总OTU的80%,我们做下游分析时,可以对少数含量的OTU进行舍弃(丰度越低的OTU,往往是不能分类的),只保留主要的OTU即可,这种策略在排序轴分析中十分重要。

         

        9.Q: 我能用miseq做功能基因分析么,分析有什么不同?

        A可以做。但必须满足条件:PCR产物长度控制在400bp-450bp左右,且有保守区。

              分析时,注释可以采用NCBI的Nt数据库,或者功能基因有专门的数据库,获得gi号码后导入NCBI Taxonomy数据库得到序列的分类信息。

               另外:即使没有任何可参考信息,我们也是可以按照OTU对样本进行分类的,物种alpha多样性分析和注释结果没有必然关系。

         

        10.Q:除了按百分比划分OTU之外还有什么方法?

        A按百分比划分OTU,是比较流行的方法,也是最公平的划分方法。还有其他常见方法:

        基于phylotype种群发育树方法:先对序列做注释,再根据注释实际结果,按门、纲、目、科、属进行分类。优点:otu数目会从1-2万降到几百种,更方便样本间比对统计;缺点:受数据库注释影响极大,质量不好的注释结果得到错误的分类。如:silva数据库细菌70多万条信息,高质量的序列也就在2-3万左右。

        基于phylip建树法:序列自身做进化树,根据进化树分支进行划分OTU。优点:更为合理,在计算样本距离中尤为准确。缺点:许多生态学指数无法用此办法统计得到。

         

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