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        • 产品名称: 引物合成服务常见问题及解答
        • 时间: 2014-12-19
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        引物合成服务常见问题及解答

         

        Q1.样品管内有一个点状物?
        答:如果寡核苷酸过度加热,将出现一个可见的点状物贴在管子的底部,但这并不影响寡核苷酸的质量,而且更容易溶解在水里面,有些非荧光标记的寡核苷酸可能出现有黄色或者其他半透明的黏状或者颗粒状物质,原因是量大或者含有吸光特性。

         

        Q2.寡核苷酸应如何保存?
        答:①干粉状态的寡核苷酸很稳定。②将寡核苷酸保存在高浓度的状况下也比较稳定。一般情况下,我们建议用RNase-free的TE (pH 8.0) 缓冲溶液溶解寡核苷酸配制成100 umol/L的储备液(溶解体积:V (ul)= 物质的量×10×OD值),分装成小份,-20℃保存。尽量避免反复冻融。③荧光探针必须避光保存。④巯基很容易被氧化成二硫键,失去原来的作用,一般管内充入氩气保护,收到产品后如果不用,请不要开盖。溶解后如果长时间不使用,请在溶液中加入适量的DTT,混匀后配成浓度为50mmol/L的溶液保存,下次使用前需要酒精沉淀纯化。

         

        Q3.测量后跟报告单上的量不符合?
        答:为避免样品丢失,开启EP管盖溶解之前最好离心1分钟,或管垂直向上在桌面上敲打几次,将样品收集到管底。
        引物可能附着在管壁上,为使寡核苷酸完全溶解,加完TE后,需保证寡核苷酸被涡旋震荡30分钟,或者上下吹打至少十次。如果以上方法均不能使测量量与报告单上的量相符合,请及时与我们联系。

         

        Q4.为什么有时候OD260/OD280小于1.8
        答:嘌呤和嘧啶消光系数并不相同,吸收最高峰在257nm-279nm之间,因此碱基组成不同的单链寡核苷酸的260nm/280nm比值范围在1.40至2.25之间,并不像双链的DNA那样,因此不能用260nm/280nm比值来衡量没有经过计算碱基组成的寡核苷酸。如果嘌呤嘧啶含量比较平均,可以通过此比值来估算衡量纯度。

         

        Q5.如何检测寡核苷酸?
        答:配制16%的变性聚丙烯酰胺凝胶,取适量的引物(不能过载),用尿素饱和溶液溶解,上样前加热变性(95 ℃,2 min)。用指示剂标记,电泳使条带尽可能靠下,然后将凝胶放在荧光TLC板上在波长254nm下观察条带位置,如果主带之下没有杂带,说明纯度较好。含有相同长度的不同碱基组成的寡核苷酸电泳速度稍有差异,含有兼并碱基的寡核苷酸容易出现弥散条带,并且容易出现二级结构(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,即引物二级结构条带)。
        不能用EB染色来检测单链寡核苷酸的长度,更不能用来定量。

         

        Q6.引物的分子量是如何计算的?
        答:引物分子量计算公式:MW= A×313.21 + G×329.21 + C×289.18 + T×304.2 + M×301.2 +R×321.21 + W×308.71 + S×309.2 +Y×296.69 + K×316.71 + V×310.53 + H×302.2 + D×315.54 + B×307.53 + N×308.95 +Ns×16 + Nm - 61.96
        公式中Ns=硫代碱基个数,Nm=修饰基团分子量。兼并碱基分子量取相应碱基分子量的平均值。

         

        Q7.如何计算引物的Tm值?
        答:引物Tm值与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。
        Tm计算公式为:Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) – 600/碱基数。
        对于长度为20base以下的引物,可以用Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)进行估算。
        注意,实际Tm也因为不同引物的碱基排列不同而有差异,公式计算出的Tm值只是一种估算,仅供参考,建议设置梯度以找到最适合的Tm。

         

        Q8.如何将两条互补的单链退火形成双链?
        答:用TE缓冲液(10 mM Tris,50 mM NaCl,1 mM EDTA,pH 7.5-8.0)溶解引物,终浓度为50~250umol/L,将要退火的引物等摩尔数混合,加热到94℃两分钟,然后缓慢冷却至室温即可。

         

        Q9.寡核苷酸片段退火后不能连接到载体上?
        答:没有特殊要求的的寡核苷酸两端均为羟基(扩增后的PCR产物的5′末端也没有磷酸基团),如果需要退火后直接连接到载体上,需要将两端磷酸化(激酶处理或者合成时说明需要磷酸化)。退火条件,磷酸化程度,酶切效果都可能影响结果。

         

        Q10.引物刚开始是可以PCR,后来就没有反应?
        答:可能是引物降解了。建议使用pH8.0左右的缓冲液低温保存引物,最好分装成多份,避免反复冻融。可将引物样品送诺赛检测是否降解,由客户承担相应费用。
        还有些引物可能自身退火或者分子内回旋配对而影响PCR效果。将引物在进行PCR前分成一小份,加热到94℃两分钟,再在冰上快速冷却引物,然后加入PCR反应。
        另一种可能是模板降解了。

         

        Q11.PCR产物经克隆后测序发现引物处的碱基有错误?
        答:并不排除其他实验问题引入的错误,所以建议挑选不少于两个克隆送测序,如果都存在相同的引物处碱基错误,我们将为您重合。

         

        Q12.当用溴化乙锭染色时,为什么看不到硫代磷酸化寡核苷酸?
        答:硫代磷酸酯键可以淬灭溴化乙锭的荧光,硫代磷酸化寡核苷酸有正常的254nm紫外吸收波长。但与溴化乙锭染色后,在365nm下没有吸收,而在同一凝胶上,没有硫代磷酸化的寡核苷酸可正常显色。

         

        Q13.FITC、5-FAM和6-FAM的荧光标记之间有何区别?
        答:都是荧光素标记(Fluorescein),5-FAM与6-FAM互为异构体,二者没有区别,而FITC则在与oligo的连接方式上(硫脲键)有别于前者(酰胺键),通常使用中没有区别,但FAM更稳定。

         

        Q14.淬灭基团TAMRA,Eclipse与BHQ系列染料的在双标记荧光探针使用上有什么不同?
        答:TAMRA为荧光染料,在淬灭报告基团的同时,自身会在更高波长处发射荧光,此发射荧光会对报告基团的检测造成部分影响,探针荧光本底相对较高。而Eclipse及BHQ系列为非荧光染料,能淬灭报告基团,但自身不发射荧光,因此,探针荧光本底低,信噪比更大,检测灵敏度更高。但每种染料在不同的位置有特异的吸收效果,所以要需要根据具体实验需求进行选择。 

         

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