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         BEAMing和微液滴数字PCR方法分析神经胶质瘤患者血清和脑脊髓液细胞外囊泡IDH1 mRNA突变

         BEAMing and Droplet Digital PCR Analysis of Mutant IDH1 mRNA in Glioma Patient Serum and Cerebrospinal Fluid Extracellular Vesicles

         

         

              神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤,简称胶质瘤。起源于神经间胶质、室管膜、脉络丛上皮、神经元等,起因至今未明,占颅内肿瘤40%左右。临床表现主要有头痛、呕吐及视乳头水肿等颅内压增高症状及局限性神经损害症状。胶质瘤呈侵袭性生长,无包膜,分界不清,恶性程度各有不同。容易复发,晚期死于脑疝。到目前为止,治疗仍以手术为主,辅以放疗+化疗,因恶性程度不同,疗效不一。

         细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EV)是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成的细胞外纳米级小囊泡。细胞外囊泡可以携带蛋白,运送RNA,在细胞间物质和信息转导中起重要作用。还有研究表明细胞外囊泡可能通过调控免疫功能,促进肿瘤血管新生和肿瘤转移,以及直接作用于肿瘤细胞等途径,影响肿瘤的进展。细胞外囊泡可应用于肿瘤的诊断。

          对于开发基于液体样本的癌症分子诊断,是做无创肿瘤鉴定和进行实时监控的重要一步。在液体样本,如血液和脑脊髓液的野生型背景序列中检测稀有点突变技术上仍具有很大挑战,需要高敏度的检测技术才能实现。本文研究者采用BEAMing PCR和微液滴数字PCR两种技术对神经胶质瘤患者的血清及脑脊髓液胞外囊泡中的1DH1 mRNA含量进行了检测。

         

        方法

         

         微滴数字PCR流程

        (1)   PCR反应混合物加入到Source微流体芯片8个样品孔的其中一个内,然后将微流体芯片放入Source仪器,并且下端样品留出孔与一个8联排PCR空管对应。PCR反应混合物在气体流的驱动下在芯片中与包含表面活性剂的氟碳油混合,制备成5pL的油滴,最后流入8联排PCR管进行收集。

        (2)   PCR管放入标准PCR仪进行扩增,包含单一模板分子的油滴能够扩增从而检测到荧光信号为(PCR+);其余大部分油滴不包含模板,无法实现扩增即为(PCR-)

        (3)   扩增后,PCR管与Sense微流体芯片连接后进行荧光检测。数据结果以2维散点图表示,软件可以对每个基因的聚类液滴进行Gating,给出每个Gate中的液滴数值。

         

        检测结果

          有5例胶质瘤病人脑脊髓液中检测到了IDH1 mRNA突变。IDH1 mRNA反转录成cDNA扩增后,1:15,000 稀释后BeaMing扩增检测,1:106稀释后ddPCR扩增检测。所得数据结果计算出的突变基因含量如上表。其中ddPCR技术检测到的突变基因含量是BeaMing检测到的2倍。

         

        结论

        胶质瘤病人脑脊髓液中的IDH1 mRNA拷贝数高于血清中mRNA拷贝数。BEAMing和ddPCR技术均能够检测得到脑脊髓液中的突变IDH1 mRNA。使用这两种技术进行突变基因检测,代表了癌症诊断方面一种有价值的新策略,类似的方法可能推广应用于其他液体样本和瘤。

         

        信息来源:怡美通德

         

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